IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) हे β-galactosidase सब्सट्रेटचे एक अॅनालॉग आहे, जे अत्यंत प्रेरणीय आहे.IPTG च्या इंडक्शन अंतर्गत, प्रेशर प्रथिनांसह एक कॉम्प्लेक्स तयार करू शकतो, ज्यामुळे रेप्रेसर प्रोटीनची रचना बदलली जाते, जेणेकरून ते लक्ष्य जनुकासह एकत्र केले जाऊ शकत नाही आणि लक्ष्य जनुक कार्यक्षमतेने व्यक्त केले जाते.तर प्रयोगादरम्यान IPTG ची एकाग्रता कशी ठरवायची?मोठे तितके चांगले आहे का?
प्रथम, IPTG इंडक्शनचे तत्त्व समजून घेऊ: E. coli च्या lactose operon (Element) मध्ये Z,Y, आणि A या तीन स्ट्रक्चरल जीन्स असतात, जे अनुक्रमे β-galactosidase, permease आणि acetyltransferase एन्कोड करतात.lacZ लॅक्टोजचे ग्लुकोज आणि गॅलेक्टोजमध्ये किंवा अॅलो-लैक्टोजमध्ये हायड्रोलायझ करते;lacY वातावरणातील लैक्टोजला सेल झिल्लीतून जाण्याची आणि सेलमध्ये प्रवेश करण्यास अनुमती देते;lacA एसिटाइल ग्रुपला एसिटाइल-कोए वरून β-गॅलेक्टोसाइडमध्ये स्थानांतरित करते, ज्यामध्ये विषारी प्रभाव काढून टाकणे समाविष्ट आहे.याव्यतिरिक्त, एक ऑपरेटिंग सीक्वेन्स O, एक प्रारंभिक क्रम P आणि एक नियामक जीन I आहे. I जनुक कोड एक रिप्रेसर प्रोटीन आहे जो ऑपरेटर क्रमाच्या O स्थितीशी बांधला जाऊ शकतो, ज्यामुळे ओपेरॉन (मेटा) दाबला जातो आणि बंद केले.इनिशिएटिंग सीक्वेन्स P च्या अपस्ट्रीममध्ये कॅटाबॉलिक जीन ऍक्‍टिवेटर प्रोटीन-सीएपी बाइंडिंग साइटसाठी एक बंधनकारक साइट देखील आहे. पी सीक्वेन्स, ओ सीक्वेन्स आणि सीएपी बाइंडिंग साइट मिळून लाख ऑपेरॉनचे नियामक क्षेत्र तयार करतात.जनुक उत्पादनांची समन्वित अभिव्यक्ती साध्य करण्यासाठी तीन एन्झाईम्सचे कोडिंग जीन्स समान नियामक क्षेत्राद्वारे नियंत्रित केले जातात.
लैक्टोजच्या अनुपस्थितीत, लाख ओपेरॉन (मेटा) दडपण्याच्या स्थितीत आहे.यावेळी, PI प्रवर्तक अनुक्रमाच्या नियंत्रणाखाली I अनुक्रमाद्वारे व्यक्त केलेला लाख रिप्रेसर O अनुक्रमाशी बांधला जातो, जो RNA पॉलिमरेझला P क्रमाशी बंधनकारक होण्यापासून प्रतिबंधित करतो आणि लिप्यंतरण आरंभास प्रतिबंधित करतो;जेव्हा लैक्टोज असते, तेव्हा लैक ऑपेरॉन (मेटा) प्रेरित केले जाऊ शकते या ओपेरॉन (मेटा) प्रणालीमध्ये, वास्तविक प्रेरक स्वतः लैक्टोज नसतो.लैक्टोज सेलमध्ये प्रवेश करतो आणि β-galactosidase द्वारे उत्प्रेरित केला जातो आणि allolactose मध्ये रूपांतरित होतो.नंतरचे, प्रेरक रेणू म्हणून, रेप्रेसर प्रोटीनशी बांधले जाते आणि प्रथिनांचे स्वरूप बदलते, ज्यामुळे ओ अनुक्रम आणि प्रतिलेखनातून रेप्रेसर प्रोटीनचे पृथक्करण होते.Isopropylthiogalactoside (IPTG) चा allolactose सारखाच प्रभाव असतो.हे एक अतिशय शक्तिशाली प्रेरक आहे, जे जीवाणूंद्वारे चयापचय होत नाही आणि ते खूप स्थिर आहे, म्हणून ते प्रयोगशाळांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाते.
IPTG ची इष्टतम एकाग्रता कशी ठरवायची?उदाहरण म्हणून ई. कोली घ्या.
सकारात्मक रीकॉम्बीनंट pGEX (CGRP/msCT) असलेले E. coli BL21 अनुवांशिकरित्या इंजिनीयर केलेले स्ट्रेन 50μg·mL-1 Amp असलेल्या LB द्रव माध्यमात टोचले गेले आणि 37°C तापमानावर रात्रभर संवर्धन केले गेले.वरील कल्चर 50mL ताज्या LB लिक्विड माध्यमाच्या 10 बाटल्यांमध्ये 50μg·mL-1 Amp असलेल्या 1:100 च्या गुणोत्तरामध्ये विस्तार संस्कृतीसाठी टोचले गेले आणि जेव्हा OD600 मूल्य 0.6~0.8 होते, तेव्हा IPTG अंतिम एकाग्रतेमध्ये जोडले गेले.ते 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 आहे.त्याच तापमानात आणि त्याच वेळी इंडक्शन केल्यानंतर, त्यातून 1 एमएल जिवाणू द्रावण घेण्यात आले, आणि बॅक्टेरियाच्या पेशी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे गोळा केल्या गेल्या आणि प्रथिनांच्या अभिव्यक्तीवर वेगवेगळ्या IPTG एकाग्रतेच्या प्रभावाचे विश्लेषण करण्यासाठी SDS-PAGE च्या अधीन केले गेले, आणि नंतर सर्वात मोठ्या प्रथिन अभिव्यक्तीसह IPTG एकाग्रता निवडा.
प्रयोगांनंतर, असे आढळून येईल की IPTG ची एकाग्रता शक्य तितकी मोठी नाही.याचे कारण म्हणजे IPTG मध्ये जीवाणूंची विशिष्ट विषारीता असते.एकाग्रता ओलांडल्याने पेशी देखील नष्ट होईल;आणि सर्वसाधारणपणे, आम्ही आशा करतो की सेलमध्ये जितके अधिक विरघळणारे प्रथिने व्यक्त केले जातील तितके चांगले, परंतु बर्याच प्रकरणांमध्ये जेव्हा IPTG ची एकाग्रता खूप जास्त असते, तेव्हा मोठ्या प्रमाणात समावेश तयार होईल.शरीर, परंतु विद्रव्य प्रथिनांचे प्रमाण कमी झाले.म्हणून, सर्वात योग्य IPTG एकाग्रता बहुतेक वेळा जितकी मोठी नसते तितकी चांगली नसते, परंतु कमी एकाग्रता असते.
अनुवांशिकरित्या अभियांत्रिकी स्ट्रेनचे इंडक्शन आणि लागवडीचा उद्देश लक्ष्य प्रोटीनचे उत्पादन वाढवणे आणि खर्च कमी करणे हा आहे.लक्ष्य जनुकाची अभिव्यक्ती केवळ स्ट्रेनच्या स्वतःच्या घटकांमुळे आणि अभिव्यक्ती प्लाझमिडमुळे प्रभावित होत नाही, तर इतर बाह्य परिस्थितींद्वारे देखील प्रभावित होते, जसे की इंड्यूसरची एकाग्रता, प्रेरण तापमान आणि प्रेरण वेळ.म्हणून, सर्वसाधारणपणे, अज्ञात प्रथिने व्यक्त आणि शुद्ध करण्यापूर्वी, योग्य परिस्थिती निवडण्यासाठी आणि सर्वोत्तम प्रायोगिक परिणाम प्राप्त करण्यासाठी प्रेरण वेळ, तापमान आणि IPTG एकाग्रतेचा अभ्यास करणे चांगले आहे.
पोस्ट वेळ: डिसेंबर-31-2021