आयपीटीजी (आयसोप्रोपिल-बीटा-डी-थायोगॅलॅक्टोसाइड) हे बीटा-गॅलॅक्टोसिडेस सबस्ट्रेटचे एक अॅनालॉग आहे, जे अत्यंत प्रेरक आहे. आयपीटीजीच्या प्रेरणेखाली, प्रेरक दमनकारी प्रथिनासोबत एक संकुल (कॉम्प्लेक्स) तयार करू शकतो, ज्यामुळे दमनकारी प्रथिनाची रचना बदलते, आणि ते लक्ष्य जनुकाशी संयोग करू शकत नाही, आणि लक्ष्य जनुकाची अभिव्यक्ती कार्यक्षमतेने होते. तर, प्रयोगादरम्यान आयपीटीजीची सांद्रता कशी निश्चित करावी? सांद्रता जितकी जास्त तितके चांगले, असे आहे का?
सर्वप्रथम, आपण IPTG प्रेरणेचे तत्त्व समजून घेऊया: ई. कोलायच्या लॅक्टोज ऑपेरॉनमध्ये (एलिमेंट) Z, Y, आणि A ही तीन संरचनात्मक जनुके असतात, जी अनुक्रमे β-गॅलॅक्टोसिडेस, परमीएज आणि ॲसिटिलट्रान्सफरेज एन्कोड करतात. lacZ लॅक्टोजचे जलविच्छेदन करून त्याचे ग्लुकोज आणि गॅलॅक्टोजमध्ये, किंवा ॲलो-लॅक्टोजमध्ये रूपांतर करते; lacY वातावरणातील लॅक्टोजला पेशीपटलातून पेशीमध्ये प्रवेश करू देते; lacA ॲसिटिल-CoA मधून ॲसिटिल गट β-गॅलॅक्टोसाइडमध्ये हस्तांतरित करते, ज्यामुळे विषारी प्रभाव दूर होतो. याव्यतिरिक्त, एक ऑपरेटिंग सिक्वेन्स O, एक स्टार्टिंग सिक्वेन्स P आणि एक नियामक जनुक I असते. I जनुक एक दमक प्रथिन (repressor protein) एन्कोड करते जे ऑपरेटर सिक्वेन्सच्या O स्थानाशी जोडले जाऊ शकते, ज्यामुळे ऑपेरॉन (मेटा) दमित होऊन बंद होतो. आरंभिक अनुक्रम P च्या वरच्या बाजूस कॅटाबोलिक जीन ॲक्टिव्हेटर प्रोटीन-CAP बंधन स्थळ (binding site) देखील असते. P अनुक्रम, O अनुक्रम आणि CAP बंधन स्थळ हे सर्व मिळून लॅक ऑपेरॉनचा नियामक प्रदेश तयार करतात. जीन उत्पादनांची समन्वित अभिव्यक्ती साधण्यासाठी, तीन एन्झाइम्सच्या कोडिंग जीन्सचे नियमन याच नियामक प्रदेशाद्वारे केले जाते.
लॅक्टोजच्या अनुपस्थितीत, लॅक ऑपेरॉन (मेटा) दमन अवस्थेत असतो. यावेळी, PI प्रमोटर सिक्वेन्सच्या नियंत्रणाखाली I सिक्वेन्सद्वारे व्यक्त होणारा लॅक रिप्रेसर, O सिक्वेन्सला जोडला जातो, ज्यामुळे RNA पॉलिमरेजला P सिक्वेन्सला जोडले जाण्यापासून रोखले जाते आणि ट्रान्सक्रिप्शनची सुरुवात थांबते; जेव्हा लॅक्टोज उपस्थित असतो, तेव्हा लॅक ऑपेरॉन (मेटा) प्रेरित होऊ शकतो. या ऑपेरॉन (मेटा) प्रणालीमध्ये, खरा प्रेरक स्वतः लॅक्टोज नसतो. लॅक्टोज पेशीमध्ये प्रवेश करतो आणि β-गॅलॅक्टोसिडेजद्वारे उत्प्रेरित होऊन त्याचे अॅलोलॅक्टोजमध्ये रूपांतर होते. नंतरचा अॅलोलॅक्टोज, एक प्रेरक रेणू म्हणून, रिप्रेसर प्रथिनाला जोडला जातो आणि प्रथिनाची रचना बदलतो, ज्यामुळे रिप्रेसर प्रथिन O सिक्वेन्सपासून वेगळे होते आणि ट्रान्सक्रिप्शन सुरू होते. आयसोप्रोपिलथायोगॅलॅक्टोसाइड (IPTG) चा प्रभाव अॅलोलॅक्टोजसारखाच असतो. हा एक अतिशय शक्तिशाली प्रेरक आहे, जो जीवाणूंमध्ये चयापचयित होत नाही आणि खूप स्थिर असतो, त्यामुळे प्रयोगशाळांमध्ये त्याचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो.
आयपीटीजीची इष्टतम सांद्रता कशी ठरवायची? ई. कोलायचे उदाहरण घेऊया.
पॉझिटिव्ह रिकॉम्बिनंट pGEX (CGRP/msCT) असलेला E. coli BL21 जनुकीय सुधारित स्ट्रेन, 50μg·mL-1 Amp असलेल्या LB द्रव माध्यमात इनोक्युलेट करण्यात आला आणि 37°C तापमानावर रात्रभर संवर्धित करण्यात आला. वरील कल्चर, विस्तार कल्चरसाठी 50μg·mL-1 Amp असलेल्या 50mL ताज्या LB द्रव माध्यमाच्या 10 बाटल्यांमध्ये 1:100 या प्रमाणात इनोक्युलेट करण्यात आले, आणि जेव्हा OD600 मूल्य 0.6~0.8 होते, तेव्हा IPTG अंतिम सांद्रतेपर्यंत मिसळण्यात आले. ही सांद्रता 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 आहे. एकाच तापमानावर आणि एकाच वेळी प्रेरणा दिल्यानंतर, त्यातून 1 मिली बॅक्टेरियल द्रावण घेण्यात आले, आणि सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे बॅक्टेरियल पेशी गोळा करून प्रोटीन अभिव्यक्तीवर वेगवेगळ्या IPTG सांद्रतेच्या प्रभावाचे विश्लेषण करण्यासाठी SDS-PAGE केले गेले, आणि नंतर सर्वात जास्त प्रोटीन अभिव्यक्ती देणारी IPTG सांद्रता निवडण्यात आली.
प्रयोगांनंतर असे दिसून येईल की, आयपीटीजीची (IPTG) सांद्रता शक्य तितकी जास्त नसावी. याचे कारण असे की, आयपीटीजीमध्ये जीवाणूंसाठी एक विशिष्ट विषारीपणा असतो. सांद्रता मर्यादेपलीकडे गेल्यास पेशी मरतात; आणि सर्वसाधारणपणे, पेशींमध्ये जितके जास्त विद्राव्य प्रथिने तयार होतील, तितके चांगले, अशी अपेक्षा असते. परंतु अनेक प्रकरणांमध्ये, जेव्हा आयपीटीजीची सांद्रता खूप जास्त असते, तेव्हा शरीरात मोठ्या प्रमाणात अंतर्भाव (inclusions) तयार होतात, पण विद्राव्य प्रथिनांचे प्रमाण कमी होते. म्हणून, आयपीटीजीची सर्वात योग्य सांद्रता अनेकदा 'जितकी जास्त तितकी चांगली' नसते, तर ती जितकी कमी असेल तितकी योग्य असते.
जनुकीय अभियांत्रिकी केलेल्या स्ट्रेन्सच्या प्रेरण आणि संवर्धनाचा उद्देश लक्ष्यित प्रथिनाचे उत्पादन वाढवणे आणि खर्च कमी करणे हा आहे. लक्ष्यित जनुकाची अभिव्यक्ती केवळ स्ट्रेनचे स्वतःचे घटक आणि अभिव्यक्ती प्लास्मिडवरच नव्हे, तर प्रेरकाची सांद्रता, प्रेरण तापमान आणि प्रेरण वेळ यांसारख्या इतर बाह्य परिस्थितींवरही अवलंबून असते. म्हणून, सामान्यतः, अज्ञात प्रथिनाची अभिव्यक्ती आणि शुद्धीकरण करण्यापूर्वी, योग्य परिस्थिती निवडण्यासाठी आणि सर्वोत्तम प्रायोगिक परिणाम मिळवण्यासाठी प्रेरण वेळ, तापमान आणि आयपीटीजी (IPTG) सांद्रतेचा अभ्यास करणे उत्तम ठरते.
पोस्ट करण्याची वेळ: ३१-डिसेंबर-२०२१